Деление

Стволовые клетки мозга обновляются ограниченно

Группа ученых из МФТИ, Университета Стоуни-Брук и Лаборатории Колд-Спринг-Харбор пронаблюдали, как делятся и расходуются нейральные стволовые клетки в гиппокампе у мышей — области мозга, критически важной для обучения и памяти. Оптимистичные прогнозы о наличии симметричного деления — когда из одной стволовой клетки получаются две — не подтвердились. Если такое деление и происходит, то не более чем в десяти процентах случаев. Это значит, что восполнение стволовых клеток, которые могли бы дать начало новым нейронам, — редкий или вовсе не происходящий процесс. Кроме этого, исследователи определили пространственные особенности исчезновения стволовых клеток в стареющем мозге. Статья опубликована в Scientific Reports.

 


Нейрогенная ниша гиппокампа. Зеленым изображены стволовые клетки (Nestin-GFP), красным — астроцитарный белок (GFAP). Трехмерная реконструкция серии конфокальных изображений / Предоставлено авторами исследования

 

Ольга Минеева, сотрудник лаборатории стволовых клеток мозга МФТИ, комментирует: «Полученные нами результаты в первую очередь говорят о том, что в нормальном зрелом мозге способность гиппокампальных стволовых клеток к обновлению путем симметричных делений ограничена. А увеличение тотального количества стволовых клеток не происходит вовсе или не сказывается значительно. Эти результаты требуют критического пересмотра ряда исследований, которые показали наличие симметричных делений нейральных стволовых клеток гиппокампа».

 

Хотя сейчас не утихают споры о возможности появления новых нейронов во взрослом мозге у человека, их генерация в мозге других взрослых млекопитающих признана неопровержимым фактом. Процесс образования новых нейронов из стволовых клеток называют нейрогенезом. После того как рост и развитие молодого мозга завершены, у большинства взрослых млекопитающих в мозге остаются лишь две области, сохраняющие стволовые клетки, ответственные за нейрогенез: тонкий слой в стенке боковых желудочков мозга (или субвентрикулярная зона) и тонкий слой в зубчатой извилине гиппокампа (или субгранулярная зона). Вторая зона вызывает особый интерес исследователей, так как находится в гиппокампе, работа которого критически важна для реализации важнейших когнитивных функций — например, обучения, памяти и эмоционального поведения. При этом современные данные показывают, что и сам нейрогенез в гиппокампе может быть важен для осуществления этих функций. Но также известно, что с возрастом количество нейральных стволовых клеток в гиппокампе падает. Поэтому перед исследователями встает целый ряд вопросов: как сохраняется пул этих стволовых клеток в ходе онтогенеза, каковы механизмы его поддержания и обновления и, главное, можно ли повлиять на эти процессы и тем самым продлить интенсивный нейрогенез до глубокой старости, а значит, и продлить молодость мозга.

 

Ключом для ответа на эти вопросы может стать выяснение того, как делятся стволовые клетки во взрослом мозге. Теоретически деление нервной стволовой клетки может происходить двумя способами (Рис. 1). Первый вариант — когда из одной стволовой клетки получаются две такие же стволовые. Такого рода деления, когда из материнской клетки образуются две подобные ей дочки, называются симметричными. Второй вариант — когда из одной стволовой клетки получаются две дочки, одна из которых — такая же, как материнская, а вторая становится предшественником нейрона. Эти деления принято называть асимметричными. Стволовые клетки могут делиться преимущественно одним способом либо использовать оба типа делений для генерации нейронов. Как видно, способ деления стволовых клеток определяет как общее число стволовых клеток, так и, следовательно, расходуется ли резерв стволовых клеток, с какой скоростью, может ли он быть восстановлен или даже увеличен.

 

Так, если стволовые клетки гиппокампа часто делятся симметрично, значит, их пул может самоподдерживаться и восстанавливаться. Потенциально фармакологическая индукция симметричных делений может даже увеличить стволовой резерв. Если же симметричные деления — крайне редкое событие, а в основном происходят асимметричные, то активация деления стволовых клеток после периода покоя приведет к неизбежному исчезновению самих стволовых клеток. Данные о снижении числа стволовых клеток с возрастом косвенно свидетельствуют в пользу второго, «пессимистичного» сценария и возможного отсутствия симметричных делений. Но как исследовать этот вопрос напрямую? Необычное решение было предложено группой ученых из МФТИ, Университета Стоуни-Брук и Лаборатории Колд-Спринг-Харбор.

 



Рисунок 1: Типы деления клеток. При симметричном делении (слева) из одной стволовой клетки (зеленые) образуются две такие же стволовые, а при асимметричном (справа) — образуются одна стволовая клетка и предшественник нейрона (красная клетка) или астроцит (фиолетовая клетка) / Пресс-служба МФТИ

 

Авторы выявляли делящиеся клетки классическим для такого рода исследований способом, а именно — вводили экспериментальным животным синтетический аналог нуклеотида тимидина — бромодезоксиуридин (БрдУ), который встраивается в удваивающиеся цепи ДНК клеток во время их деления (мы уже рассказывали об этом методе, когда писали про другую работу этой же группы исследователей). О том, что поделились именно стволовые клетки гиппокампа, судили по другому маркеру — зеленому флуоресцентному белку (GFP), синтез которого находился под контролем регулирующей последовательности гена белка нестина — маркера стволовых клеток. От других предшественников нейронов стволовые клетки отличает их особая узнаваемая форма: они имеют крупное тело и один длинный апикальный отросток, сильно ветвящийся сверху. Таким образом, если в зубчатой извилине гиппокампа происходят симметричные деления стволовых клеток, такие деления на срезах можно увидеть как пару близкорасположенных зеленых клеток с крупным апикальным отростком и с БрдУ в ядрах. Однако меченые клетки могут оказаться рядом не только из-за симметричного деления. Они могут быть потомками не одной клетки, а двух разных соседствующих, каждая из которых поделилась асимметрично (Рис.2). Возникает вопрос, как различать эти две ситуации.

 



Рисунок 2: На срезе мозга находятся помеченные БрдУ стволовые клетки (фрагмент посередине) среди множества неделящихся или покоящихся стволовых клеток (светло-зеленые). Такие меченые пары могут встречаться или из-за активации асимметричного типа деления двух неродственных стволовых клеток, находящихся рядом (вариант слева), или из-за симметричного деления одной стволовой клетки (справа). / По рисунку, предоставленному Ольгой Минеевой, автором статьи. Пресс-служба МФТИ

 

Ученые придумали статистический метод, с помощью которого можно оценить, случайно ли меченые клетки оказались рядом или неслучайно. А именно — вследствие их происхождения от двух разных материнских клеток, поделившейся асимметрично (Рис. 1, левая часть) или от общей материнской клетки, поделившейся симметрично (Рис. 1, правая часть). Суть метода заключалась в измерении реально наблюдаемой вероятности обнаружения пар меченых стволовых клеток и ее сравнении с полностью случайной вероятностью, которую можно искусственно смоделировать в общей популяции стволовых клеток. В результате: если реально наблюдаемое число пар будет выше смоделированного случайного, то это значит, что возникновение не всех пар можно объяснить случайностью и часть из них образовались в результате симметричных делений.

 

Для того чтобы измерить реальное и смоделированное случайно число пар клеток, на микроскопических изображениях срезов находили местоположение всех стволовых клеток, содержащих и не содержащих маркер делений БрдУ. Таким образом, для каждой клетки было определено ее положение в пространстве. Затем по полученным координатам определяли расстояния между парами реально наблюдаемых меченых клеток и число пар клеток на конкретных расстояниях (Рис. 3А). Потом искусственно моделировали случайное распределение меченых клеток для сравнения. Для этого использовали все положения, в которых могли появиться меченые клетки, то есть координаты всех делящихся и неделящихся стволовых клеток. Из списка координат с помощью генератора случайных чисел выбирали такое же количество клеток, что наблюдалось на срезе в действительности, и условно принимали их за меченые. Получался тот же срез, но теперь уже с псевдомечеными клетками, разбросанными на нем случайным образом (Рис.3Б). Допустим, если мы увидели 11 меченых клеток на срезе (как на Рис.3А), то среди всех возможных позиций будет разбросано 11 псевдомеченых клеток (Рис.3Б) и рассчитано распределение расстояний между ними. Эту операцию повторили много раз для получения статистики со всех срезов.

 

Сравнив реальное распределение с моделируемым случайным, авторы увидели, что они не отличаются друг от друга. Однако отсутствие различий между реальной и случайно сгенерированной картиной могло быть связано с низкой чувствительностью метода. Чтобы проверить это, исследователи попробовали добавлять в модель заданное количество пар сближенных делящихся клеток и оценивать, сколько симметричных делений нужно, чтобы новое искусственно сгенерированное распределение начало отличаться от случайного. Получилось, что нужно добавить больше 10% событий симметричных делений. Из этого ученые сделали вывод, что в реальном взрослом гиппокампе симметричных делений нервных стволовых клеток не происходит или же они происходят, но крайне редко и их доля составляет не больше 10%.

 



Рисунок 3: Схема расположения стволовых реальных клеток на срезе и в модели. Серые точки — неделящиеся стволовые клетки. Черные точки — реально обнаруженные меченые клетки. Голубые точки — случайно разбросанные псевдомеченые клетки / Пресс-служба МФТИ

 

Этот же метод авторы применили, чтобы описать исчезновение стволовых клеток с возрастом. Чем старше мышь, тем меньше стволовых клеток остается в нейрогенной зоне гиппокампа. Например, у семимесячной мыши их в девять раз меньше, чем у двухнедельной, и в пространстве, где поначалу были стволовые клетки, в нейрогенном резерве обнаруживаются пустоты.

 

Авторы смоделировали старение нейрогенной зоны мышиного гиппокампа, проделав ту же самую операцию случайного перебора, что и в первом эксперименте. Однако теперь среди всех доступных клеток у молодых мышей они случайно выбирали и оставляли то количество, которое в действительности наблюдалось в гиппокампе у семимесячной мыши. Оказалось, что оставшиеся стволовые клетки в настоящем гиппокампе семимесячных мышей распределены более равномерно, чем случайно выбранные. На основании этого исследователи делают вывод о том, что исчезновение стволовых клеток гиппокампа зависит от их положения в пространстве: клетки, расположенные поблизости друг от друга, имеют больший шанс к скорому исчезновению, что приводит к пустотам в слое стволовых клеток. Более того, специалисты выяснили, что в разных отделах гиппокампа стволовые клетки расходуются с разной степенью неравномерности. Интересно то, что разные зоны гиппокампа отвечают за разные когнитивные функции. Однако ученые не спешат связывать такое исчезновение стволовых клеток с функциональными особенностями — возможно, это связано с более простыми факторами, например с распределением сосудов.

 

Последняя работа этих авторов новым способом подтвердила ранее выдвинутое предположение о том, что стволовые клетки не могут обновляться бесконечно. Ранее на основе других данных авторами настоящего исследования была выдвинута концепция, согласно которой каждая стволовая клетка, выйдя из состояния покоя, проходит ограниченное число клеточных делений, давая начало новым нейронам и астроцитам, но не новым стволовым клеткам (Encinas et al., 2011). Важное следствие этой концепции о невосполнимости пула покоящихся стволовых клеток гиппокампа — возможное негативное влияние веществ, активирующих деления стволовых клеток, на нейрогенез в гиппокампе в долгосрочной перспективе. Так, увеличивая нейрогенез через усиленное рекрутирование стволовых клеток, эти факторы могут вызывать преждевременное истощение нейрогенной ниши и как возможное следствие этого — привести к когнитивным нарушениям из-за последующей нехватки новых нейронов.

 



Рисунок 4: A) Оставшиеся стволовые клетки у семимесячной мыши. В) Стволовые клетки двухнедельной мыши, среди которых случайным образом выбрано (голубым) такое же количество клеток, которое осталось у семимесячной. C, D) Реальное распределение расстояний между ближайшими клетками (красным) отличается от случайного (голубым) / Пресс-служба МФТИ

 

Григорий Ениколопов, заведующий лабораторией стволовых клеток мозга МФТИ: «Тотального запрета на симметричные деления может и не быть, и увеличение стволовых клеток в количестве возможно при определенных условиях. Поиск таких воздействий, стимулирующих деление и обновление нейральных стволовых клеток, но одновременно не истощающих их пул преждевременно, должен продолжаться».